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免疫組化操作步驟
第一節 免疫組化操作步驟及抗原修復(供參考)
一、免疫組化操作步驟
(一)、儀器設備

1、 18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或用微波爐

2、 水浴鍋

(二)、試 劑

1、 PBS緩沖液(pH7.2―7.4)

2、 0.01mol/L檸檬酸鈉緩沖液(CB,pH6.0,1000ml)

3、 3%甲醇―H2O2溶液:用30% H2O2 和80%甲醇溶液配制

4、 風裱劑:

a. 甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.0–9.5)等量混合

b. 油和TBS(PBS)配制

5、 TBS/PBS pH9.0–9.5,適用于熒光纖維鏡標本;pH7.0-7.4適合光學纖維標本

(三)、操作流程

1、 脫蠟和水化:脫蠟前應將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘

a. 組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘,更換二甲苯后在浸泡10分鐘

b. 無水乙醇中浸泡五分鐘

c. 95%乙醇中浸泡五分鐘

d. 75%乙醇中浸泡五分鐘

2、 抗原修復:用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片

二、抗原修復(免疫組化石蠟切片)

用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片需要抗原修復。

福爾馬林固定的組織有可能破壞了原來組織的抗原結構,蛋白多肽發生交聯,導致部分抗原表位封閉,結合位點減少,所以需要抗原修復,以暴露原來的抗原表位,達到充分顯露抗原,以不出現明顯脫片現象為佳。

抗原修復的幾種常用方法(供參考)

1、 微波爐加熱:

在微波爐里加熱0.01枸櫞酸鈉緩沖液(pH6.0)至沸騰后將組織芯片放入,斷電,間隔5-10分鐘,反復1-2次。根據玻片情況可參考采用微波加熱“3-5-3法”3分鐘溫火沸騰后靜止5分鐘,再溫火沸騰3分鐘即可。

適用的抗原:來源于人、大鼠、小鼠的組織標本;來源于其他動物種屬的組織標本。

2、 沸熱修復:

電爐或水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖液(pH6.0)至95℃左右,放入組織芯片加熱10-15分鐘。

3、 高壓熱修復:

在沸水中加入EDTA(pH8.0)或0.01m枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0).蓋上不銹鋼鍋蓋,但不能鎖定。將玻片置于金屬染色架上,緩慢加壓,使玻片在緩沖液中浸泡五分鐘,然后將蓋子鎖定,小閥門將會升起來。10分鐘后除去熱源,置入涼水中,當小閥門沉下去后打開蓋子。此方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復。(骨及軟骨組織的標本最好選擇較溫和的微波加熱修復) 。

4、 酶消化方法:

常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預熱37℃,消化時間約為5-30分鐘。

適用于被固定遮蔽的抗原:包括 Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.c-erB-2.LCA.LN.等。

三、石蠟切片免疫組化染色步驟

1、三步法(以SP試劑盒為例)

- 石蠟切片脫蠟至水

- 蒸餾水沖洗,PBS浸泡5分鐘,如果采用抗原修復,可在此步后進行

- 3% H2O2 室溫孵育5~10分鐘,以消除內源性過氧化物酶的活性,PBS沖洗,2分鐘×3次

- 5~10%正常山羊血清封閉,室溫孵育10分鐘。傾去血清,勿洗,滴加適當比例稀釋的一抗或一抗工作液,37℃孵育1~2小時或4℃過夜

- PBS沖洗,2分鐘×3次

- 滴加適當比例稀釋的生物素標記二抗(1%BSA-PBS稀釋),37℃孵育10~30分鐘;或滴加第二代生物素標記二抗工作液,37℃或室溫孵育10~20分鐘

- PBS沖洗,2分鐘×3次

- 滴加適當比例稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素(PBS稀釋),37℃孵育10~30分鐘;或第二代辣根酶標記鏈霉卵白素工作液,37℃或室溫孵育10~20分鐘

- PBS沖洗,2分鐘×3次

- 顯色劑顯色(DAB或AEC)

- 自來水充分沖洗,復染,脫水透明、封片

- 如果必要,可選用avdin封閉內源性生物素

2.SABC法

- 脫蠟、水化

- PBS洗2次各5分鐘

- 用蒸餾水或PBS配制新鮮的3% H2O2 ,室溫封閉5-10分鐘,用蒸餾水洗3次

- 抗原修復

- PBS洗5分鐘

- 滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘,甩去多余液體

- 滴加Ι抗50ul,室溫靜置1小時或4℃過夜或37℃1小時

- PBS洗3次各2分鐘

- 滴加生物素化Ⅱ抗,20℃-37℃ 20分鐘

- PBS洗3次各2分鐘

- 滴加試劑SABC 20℃-30℃ 20分鐘

- PBS洗4次各5分鐘

- DAB顯色:試劑盒或自配顯色劑顯色

- 脫水、透明、封片、鏡檢

四、冰凍切片的免疫組化染色步驟

- 速凍組織

- 冰凍切片4~8μm,冰凍切片后如不染色,必須吹干,儲存低溫冰箱內,或進行短暫預固定后儲存于-20℃冰箱

- 室溫放置30分鐘后,入4℃丙酮固定10分鐘,也可根據需要選擇其他的固定方式

- PBS沖洗,5分鐘×3次

- 用3%過氧化氫孵育5~10分鐘,消除內源性過氧化物酶的活性

- PBS沖洗,5分鐘×3次

- 下接石蠟切片免疫組化染色操作步驟(滴加一抗開始)

第二節 免疫組化抗原熱修復的技術要點(供參考)
一、抗原熱修復溫度和時間的關系

我們日常工作中所使用的組織固定液福爾馬林會引起組織蛋白內或蛋白之間的亞甲基發生橋連,具體過程如下:

第一步:基本反應福爾馬林和氫反應形成新的化合物;

第二步:基本反應福爾馬林和氫反應形成新的亞甲基橋。

上述反應的結果導致許多抗原決定簇被封閉,而加熱可以水解該橋連使抗原被激活。影響抗原熱修復的兩個最關鍵的因素是溫度和時間,有人將這兩種因素對抗原修復的影響總結為下面的公式: 抗原熱修復的有效性=加熱溫度(T) × 加熱時間(t)。

也就是說當我們修復時的溫度越低則需要修復的時間就越長;反過來當修復溫度增高時修復的時間可以適當地縮短,才能使抗原決定簇完全暴露,這種反比的關系從MBI單克隆抗體的實驗結果“表1”中也可以清楚地看出。

表1 時間和溫度對染色的影響
  • 時間(分鐘)
  • 100℃
  • 80℃
  • 60℃
  • 5×2
  • + + +
  • 5×6
  • + + + +
  • + + +
  • 5×10
  • + + + +
  • +
  • 10小時
  • + +

如果修復強度不夠,免疫組織化學染色所顯示的只能是修復后暴露的部分抗原決定簇,而不是組織所含的全部抗原。這樣的染色結果可能會非常弱,或出現假陰性,即使是陽性結果,充其量只能起到定性的作用,不能適應今后對免疫組化進行定量的需要。這就給我們診斷中定量指標的應用帶來困難,例如用來測定耐藥的指標。

二、組織固定時間和所需的抗原熱修復的關系

大量的實驗表明,固定時間越長的標本,它所形成的橋連就越緊密,抗原就越難以被激活,所需要的修復強度也就越強。有意思的是隨著固定時間的延長,組織中蛋白對溫度的耐受也相應增高,這可能就是我們對固定時間長的標本加大修復強度的理論基礎。

這就提醒我們在做回顧性的研究時一定要注意所使用的修復條件,它與新鮮標本的修復條件一定是有所區別的,同等條件下一定要加長修復的時間或提高修復所使用的溫度,才可能得到比較滿意的結果。

三、不同pH值抗原修復液對染色結果的影響

抗原熱修復中所使用的修復液pH值也會對染色結果產生相當大的影響。

pH值對染色結果的影響大概可以分為以下四種情況:

A.穩定型,pH值對染色結果影響不大,如PCNA、AE1、EMA、CD20等;

B.V型,高pH值和低pH值染色較好,而pH值4-5染色結果較差,如ER、Ki-67等;

C.上升型,隨著pH值的增加,染色結果逐漸增強,如HMB45等;

D.下降型,隨著pH值的增加染色結果逐漸減弱,當然這種類型的抗體只是個別的現象,如MOC31。

一個有趣的現象值得注意,即在高pH值都有較好的染色結果,所以目前比較推崇的抗原修復液為高pH值得修復液,如1mMEDTA, pH8.0或pH9.0等。但是由于傳統習慣,絕大多數醫院和實驗室都在使用pH6.0的枸櫞酸緩沖液。綜合以上各種抗體的染色狀況,考慮到臨床工作的實際情況,許多國外免疫組化專家建議,在常規的免疫組化工作中,全部選用高pH值得修復液來代替目前廣為使用的pH6.0枸櫞酸緩沖液。為此,本公司已經推出pH8.0和pH9.0的新型抗原修復液。經驗證,絕大多數的抗體使用pH9.0得修復液效果都要優于pH6.0的枸櫞酸,尤其是核陽性的抗體。所以,在常規的免疫組化工作中,使用高pH值的抗原修復液是今后的必然趨勢。

四、抗原熱修復的手段
表2 微波爐修復和高壓鍋修復的比較
  • 溫度
  • 壓力
  • 時間
  • 受熱
  • 微波爐
  • 100℃
  • 1P
  • 15~20分鐘
  • 不均勻
  • 高壓鍋
  • 120℃
  • 1.2P
  • 噴氣2分鐘
  • 均勻

目前抗原熱修復所采用的方法主要有微波爐修復和高壓鍋修復兩種,從“表2”中可以看出,由于高壓鍋修復具有溫度均一、節省時間、效果穩定等特點,已經越來越受到人們的青睞。

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