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Western Blotting 問題解答
1、膠片上存在反轉印象(如:亮的條帶、黑的背景)?

原因:HRP的濃度過高;

解決:稀釋HRP至少10倍。

2、膜上有黃色或棕色的沉積?

原因:HRP的濃度過高;

解決:稀釋HRP至少10倍。

3、在暗室中條帶過于明亮?

原因:HRP的濃度過高;

解決:稀釋HRP至少10倍。

4、條帶的發光時間持續了至少8小時?

原因:HRP的濃度過高;

解決:稀釋HRP至少10倍。

5、信號太弱或沒有?

原因:

1.太多的HRP積聚導致信號快速的消退;

2.抗原或抗體的濃度不夠;

3.轉印不成功;

4.HRP或其他底物的效價降低。

解決:

1.稀釋HRP至少10倍;

2.增加其濃度;

3.尋找合適的轉移方法和條件;

4.選擇其他的合適底物。

6、背景高?

原因:

1.HRP濃度過高;

2.封閉無效;

3.不適合的封閉試劑;

4.洗滌不充分和洗滌液的量;

5.膠片曝光過度;

6.抗原或抗體的濃度太高。

解決:

1.稀釋HRP至少10倍;

2.尋找合適的封閉方法;

3.選用其他的封閉試劑;

4.增加洗滌的時間,次數;

5.減少曝光時間;

6.稀釋抗原或抗體。

7、蛋白質條帶上有空泡影像?

原因:

1.蛋白質沒有被充分轉印;

2.膜沒有預先浸濕;

3.在膠片和膜之間有氣泡。

解決:

1.尋找合適的轉移方法和條件;

2.在轉印前充分浸濕;

3.在暴光之前趕走氣泡。

8、膠片上背景彌散?

原因:HRP標記的抗體出現了積聚;

解決:稀釋HRP至少10倍。

9、無特異性條帶?

原因:

1.HRP濃度過高;

2.SDS促使非特異蛋白質條帶黏附在目的蛋白質條帶上。

解決:

1.稀釋HRP至少10倍;

2.在操作過程中不要加SDS。

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